基本信息
物化性质
外观与性状:紫红色固体
沸点:757.8ºC at 760 mmHg
熔点:>300°C
闪点:412.1ºC
水溶解性:soluble
沸点:757.8ºC at 760 mmHg
熔点:>300°C
闪点:412.1ºC
水溶解性:soluble
安全信息
RTECS号:LM5920000
安全说明:S22-S24/25-S37/39-S26
WGK Germany:3
危险类别码:R36
危险品标志:Xi
安全说明:S22-S24/25-S37/39-S26
WGK Germany:3
危险类别码:R36
危险品标志:Xi
生产方法及用途
生产方法
方法一、重组TNFα的工艺过程细菌发酵 将工程菌接种于LB培养基,37℃震荡培养至A600nm=1,转至M9培养基,于42℃诱导4h。离心,收集菌体。用pH为8的磷酸盐缓冲液(PB,10mmol/L)悬浮菌体,并用超声破碎菌体,离心收集上清液,对PB透析,得TNFα粗品。工程菌[培养、发酵]→[37℃、42℃]发酵菌体[10mmol/L PB]→[pH8]TNFα粗品DEAE-Sepharose FF 离子交换柱层析 离子交换柱用PB平衡,加TNFα粗品,用PB洗柱,再加75 mmol/L NaCl洗脱,收集各峰,测TNFα活性。TNFα粗品[DEAE-Sepharose FF离子柱]→[75 mmol/L NaCl]TNFα活性组分IQ-Sepharose FF离子交换柱层析 离子交换柱用pH 8、20 mmol/LTris-HCl缓冲液平衡,然后加TNFα活性组分I,用80 mmol/L NaCl洗脱,收集各峰,测TNFα活性,得TNFα活性组分II。TNFα活性组分I[Q-Sepharose FF离子柱]→[80 mmol/L NaCl]TNFα活性组分IICM-Sepharose FF离子交换柱层析 离子交换柱用pH为6的10mmol/L PB平衡,加TNFα活性组分II,再依次用该PB液、PB液加200mmol/L NaCl及PB液加600 mmol/L NaCl分步洗脱,收集各洗脱液,测TNFα活性,即得TNFα纯品(在4℃时,通过三次常压离子交换,电泳表明:PB液加600 mmol/L NaCl的洗脱峰为TNFα单一条带,可得TNFα纯品)。TNFα活性组分II[CM-Sepharose FF离子柱]→[PB、200及600mmol/L NaCl]TNFα纯品方法二、对合成的TNFα突变改造突变改造 用多位点突变引物和PCR方法对合成的TNFα基因突变改造,使其第二位精氨酸密码子CGT变为赖氨酸密码子AAA,即得突变基因TNF-K2。TNFα基因[多位点突变引物、PCR方法]→TNF-K2转化、重组 将TNF-K2插入载体pSB-92的PL启动子下游,转化E.coliJM103,经酶切鉴定筛选转化子,得重组质粒pSB-TNF-K2。TNF-K2[pSB-92]→pSB-TNF-K2培养、诱导 将pSB-TNF-K2于30℃培养至对数生长期,于42℃诱导4h,即得突变体[Lys2]TNFα,其分子量为17kD,比活性为6.8×107U/mg 蛋白,是一种可溶性蛋白质。pSB-TNF-K2[30℃, 42℃, 4h]→[Lys2]TNFα.
用途
用作银量法的吸附指示剂和生物染色剂。主要用于抗肿瘤和抗病毒综合征的治疗。
方法一、重组TNFα的工艺过程细菌发酵 将工程菌接种于LB培养基,37℃震荡培养至A600nm=1,转至M9培养基,于42℃诱导4h。离心,收集菌体。用pH为8的磷酸盐缓冲液(PB,10mmol/L)悬浮菌体,并用超声破碎菌体,离心收集上清液,对PB透析,得TNFα粗品。工程菌[培养、发酵]→[37℃、42℃]发酵菌体[10mmol/L PB]→[pH8]TNFα粗品DEAE-Sepharose FF 离子交换柱层析 离子交换柱用PB平衡,加TNFα粗品,用PB洗柱,再加75 mmol/L NaCl洗脱,收集各峰,测TNFα活性。TNFα粗品[DEAE-Sepharose FF离子柱]→[75 mmol/L NaCl]TNFα活性组分IQ-Sepharose FF离子交换柱层析 离子交换柱用pH 8、20 mmol/LTris-HCl缓冲液平衡,然后加TNFα活性组分I,用80 mmol/L NaCl洗脱,收集各峰,测TNFα活性,得TNFα活性组分II。TNFα活性组分I[Q-Sepharose FF离子柱]→[80 mmol/L NaCl]TNFα活性组分IICM-Sepharose FF离子交换柱层析 离子交换柱用pH为6的10mmol/L PB平衡,加TNFα活性组分II,再依次用该PB液、PB液加200mmol/L NaCl及PB液加600 mmol/L NaCl分步洗脱,收集各洗脱液,测TNFα活性,即得TNFα纯品(在4℃时,通过三次常压离子交换,电泳表明:PB液加600 mmol/L NaCl的洗脱峰为TNFα单一条带,可得TNFα纯品)。TNFα活性组分II[CM-Sepharose FF离子柱]→[PB、200及600mmol/L NaCl]TNFα纯品方法二、对合成的TNFα突变改造突变改造 用多位点突变引物和PCR方法对合成的TNFα基因突变改造,使其第二位精氨酸密码子CGT变为赖氨酸密码子AAA,即得突变基因TNF-K2。TNFα基因[多位点突变引物、PCR方法]→TNF-K2转化、重组 将TNF-K2插入载体pSB-92的PL启动子下游,转化E.coliJM103,经酶切鉴定筛选转化子,得重组质粒pSB-TNF-K2。TNF-K2[pSB-92]→pSB-TNF-K2培养、诱导 将pSB-TNF-K2于30℃培养至对数生长期,于42℃诱导4h,即得突变体[Lys2]TNFα,其分子量为17kD,比活性为6.8×107U/mg 蛋白,是一种可溶性蛋白质。pSB-TNF-K2[30℃, 42℃, 4h]→[Lys2]TNFα.
用途
用作银量法的吸附指示剂和生物染色剂。主要用于抗肿瘤和抗病毒综合征的治疗。
毒性
毒性类型/接触途径 | 测试类型 | 测试物种 | 剂量/时间 | 毒性作用 |
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致瘤性毒性 (口服) | TDLo - 公布的最低毒性剂量 | 啮齿动物 - 小鼠 | 707 gm/kg/2Y-C | 1、致癌性-通过RTECS标准来评估肿瘤 2、内分泌毒性-甲状腺肿瘤 |
生殖毒性 (口服) | TDLo - 公布的最低毒性剂量 | 啮齿动物 - 大鼠 | 650 mg/kg,女性受孕后8-20天 | 1、生殖毒性-对胚胎或胎儿的影响-胎儿毒性(除死亡外 ,例如发育不良的胎儿) |
生殖毒性 (口服) | TDLo - 公布的最低毒性剂量 | 啮齿动物 - 大鼠 | 400 mg/kg,受孕后8-15天(女) | 1、生殖毒性-对新生儿的影响-增长统计(例如减少/增加的体重%) |